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对于广大刚接触流式细胞术的小伙伴们来说，流式上机的难点之一是补偿的调节。比如，到底要选择哪一管来调节补偿呢？这是小伙伴们经常会问的问题。通常我们会使用单染管来调节各个通道间的补偿。除了使用细胞，我们其实还可以借助其他辅助工具来调节补偿。今天我们就来介绍一下补偿调节中的辅助工具---补偿微球( Biolegend Compensation beads. Cat. No. 424601, 424602 )。
补偿微球含有能够结合荧光偶联抗体的小合成颗粒，结合抗体的微球与惰性未结合抗体的微球混合，能够产生模拟样品细胞群的阳性和阴性荧光群体。补偿微球也可用于设置流式细胞仪的补偿和电压值。
在应用传统流式仪进行多色流式实验时，由于荧光光谱峰信号具一定宽度，在有限可见光波长范围内，两两荧光间的光谱难免发生重叠，这样在滤光片的分光作用下就会出现荧光溢漏现象。如下图所示：
为了确保荧光信号的检测具有特异性，调节补偿的目的是将混入该通道的其他荧光染料的信号进行扣除。 为了计算需要多少量的补偿，在每次实验中都需要使用单染管做对照，补偿微球或实验中的细胞进行抗体染色，都可以用作单色对照。
在某些条件下，补偿微球比生物样品更适合使用:
• 如果有已知/预期的染色结果，参数设置与标准化可以做试剂(如补偿珠)。染色存在/强度不会受样品变异性的影响。
• 如果是珍贵或稀有的样品，可以使用补偿珠，避免在使用样品进行仪器设置或用于数据分析之间纠结。
• 在某些组合中，某些抗体的抗原靶点可能低水平表达，因此很难获得具体的阳性/阴性群体。在这种情况下，补偿微球是一个很好的选择。
Ø 补偿管的荧光素选择与样本管一致
Ø 补偿管中阴阳群必须都是微球或者都是样本细胞，不可以出现阴性群采用微球，但阳性群采用细胞来调节的情况。要保证阴阳群带有相同的自发荧光。
Ø 电压相同的情况下，选择表达强的指标，结合荧光素作单阳管，这样补偿的计算才更加准确。
Ø 收集足够的单阳管细胞，以得到准确地计算结果。
Ø 无论是用细胞做单阳管，还是用补偿微球做单阳管。都需要用细胞调节FSC/SSC,以及每个通道荧光通道的电压。
补偿微球为流式细胞分析的补偿设置提供一种一致、准确并简易使用的工具。 一致的荧光补偿微球可帮助用户避免因使用较弱荧光样品细胞进行补偿设置时而产生的不良补偿效果。取代了客户使用样本染相同荧光素的强表达maker来替代同荧光素的弱表达maker来调节补偿。
Ø 使用方法简单，孵育后上机即可。
Ø 不消耗用户的样本（特别是样本稀有的时候）。
Ø 绝大多数荧光，可以得到和样本细胞单染管同样的甚至更好的补偿。
Ø 弱表达的marker，用补偿微球做补偿更有优势。
（Biolegend Compensation beads Cat. No. 424601, 424602)：
1. 在使用前剧烈涡旋beads，分散储存期间可能形成的聚集物。
2. 在单染管中加入阳性微球和阴性微球各一滴（约25~30μL）。
3. 准备适当抗体来制备单染管。
4. 混匀，室温下避光孵育15-20分钟。
5. 用细胞染色缓冲液洗珠(Cat.No.420201)或等效的缓冲液清洗微球。
6. 350Xg离心5分钟，并重新悬浮于细胞染色缓冲液中。微球已经准备好，可以上机检测了。
注意：不管是不是胞内指标，用微球都不需要固定破膜
Biolegend补偿微球官网英文版操作步骤：
图片来源：https://www.biolegend.com/en-us/compensation-beads
小伙伴经常会问的一个小问题：为什么死活染料用微球染不出来？
答：微球主要应用于抗体单染，但是死活染料不是抗体，当然染不出来啦~所以死活染料的单染，一般用处理过的细胞来做单染管。
1. 两种规格：25T（Cat#424601）和100T（Cat#424602）;
2. 两个组分：1滴管瓶阴性微球和1滴管瓶阳性微球；
3. 多种属反应性：能够结合小鼠、大鼠、兔、驴、仓鼠和人类抗体等多种亚型；
4. 多激光适用性：适用于蓝色（488nm）、绿色（532nm）、黄色/绿色（561nm）、
紫色（405nm）和红色（633-635nm）激发的染料。
5. 兼具功能性和经济实用性。
Ø 抗体和补偿微球中的阳性微球结合。
Ø 阴性微球+阳性微球+抗体，替代平日设置的以细胞为样本的单染管，展示清晰的阴性群和阳性群，以进行补偿调节。
补偿微球染色示意图
图片来源：https://www.biolegend.com/en-us/compensation-beads
图片来源：https://www.biolegend.com/en-us/compensation-beads
BioLegend补偿微球效果示意图。
上图是用23种不同的FITC偶联的同种型小鼠，大鼠，兔子，驴，仓鼠和人源抗体，染色补偿微球的效果。每次试验用0.05µg抗体染色。
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